๋ฏธ์Šคํ„ฐ ์…˜์ƒค์ธ 5ํ™” ๋‹ค์šด๋กœ๋“œ

6. Februar 2020 at 06:47

IRESs๊ฐ€ ํฐ์ง€ ์—ฌ๋ถ€์— ๊ด€๊ณ„์—†์ด (โˆผ450 nt; ์†Œ์•„๋งˆ๋น„ ๋ฐ”์ด๋Ÿฌ์Šค, ๋‡Œ์ฒ™์ˆ˜์—ผ ๋ฐ”์ด๋Ÿฌ์Šค) ๋˜๋Š” ์ž‘์€ (์˜ˆ๋ฅผ ๋“ค์–ด, 189 nt; dicistroviruses์˜ ๊ฐ„ ์˜์—ญ IRES), ๊ทธ๋“ค์€ ๊ธฐ๋Šฅ์„ ์œ„ํ•œ ์„ธํฌ ๋‹จ๋ฐฑ์งˆ ์š”์ธ์˜ ํ˜‘๋ ฅ์„ ์š”๊ตฌํ•˜๋Š” RNA ์„ธ๊ทธ๋จผํŠธ์ž…๋‹ˆ๋‹ค. ์ด๊ฒƒ์€ ํ•ตํ•ต ์‹œ์Šคํ…œ๊ณผ ๋Š” ๋Œ€์กฐ์ ์ž…๋‹ˆ๋‹ค. ์˜ˆ๋ฅผ ๋“ค์–ด, ๋Œ€์žฅ๊ท ์˜ ๋‹ค์ค‘ cistronic mRNA์— ์žˆ๋Š” ORFs๋Š” ์ƒค์ธ-๋‹ฌ๊ฐ€๋ฅด๋…ธ ์„œ์—ด(S/D ์„œ์—ด(S/D ์‹œํ€€์Šค(5โ€ฒ-AGGAGG-3โ€ฒ)(34, 35)์— ์žˆ๋Š” ์ƒํ˜ธ ๋ณด์™„์ ์ธ ์„œ์—ด์— ๊ฒฐํ•ฉํ•˜์—ฌ ๋ฆฌ๋ณด์†Œ๋ง 16S rRNA(5.Kr)์˜ 3โ€ฒ์˜ ์ƒ๋ณด์„œ์—ด์— ๊ฒฐํ•ฉํ•˜์—ฌ ๋‚ด๋ถ€ ๋ฆฌ๋ณด์ข€ ์ง„์ž… ๋ถ€์œ„๋กœ ๊ธฐ๋Šฅํ•œ๋‹ค(S/D ์„œ์—ด)๊ฐ€ ์„ ํ–‰๋œ๋‹ค. ์ง„ํ•ต IRESs์˜ ๋ฐœ๊ฒฌ์€ ๋˜ํ•œ S/D ์„œ์—ด ๊ฐ™์ด ์ž‘๋™ํ•  ์ˆ˜ ์žˆ๋Š” IRES์— ์žˆ๋Š” RNA ์ˆœ์„œ๋ฅผ ์œ„ํ•œ ๊ฒ€์ƒ‰์„ ์ž๊ทนํ–ˆ์Šต๋‹ˆ๋‹ค. ์ดˆ๊ธฐ ์ž‘์—…์€ ํ”ผ์ฝ”๋‚˜ ๋ฐ”์ด๋Ÿฌ์Šค IRESs์˜ oligopyrimidine ์„ธ๊ทธ๋จผํŠธ์— ์ง‘์ค‘, ๊ทธ๋Ÿฌ๋‚˜, „์‹œ์ž‘ ์ฐฝ“์œผ๋กœ IRES์˜ ๋‹ค๋ฅธ ์„ธ๊ทธ๋จผํŠธ์™€ ํŠน์ • ์กฐํ•ฉ์—์„œ ๋ด‰์‚ฌ ํ•˜๋Š” ๊ฒƒ์œผ๋กœ ๋‚˜ํƒ€๋‚ฌ์Šต๋‹ˆ๋‹ค (36, 37). ์˜ˆ์™ธ์  ์ธ ๊ฒฝ์šฐ๋Š” 9-nt-๊ธด ์„œ์—ด (5โ€ฒ-CCGGCGGGU-3โ€ฒ) Gtx homeodomain ๋‹จ๋ฐฑ์งˆ์„ ์ฝ”๋”ฉ ํ•˜๋Š” mRNA์˜ IRES์—์„œ ๋ฐœ๊ฒฌ, 18S rRNA์— ๊ธฐ๋ณธ ํŽ˜์–ด๋งํ•˜ ์—ฌ ๋ฒˆ์—ญ์„ ํ™œ์„ฑํ™” (38, 39). ์šฐ๋ฆฌ๋Š” 18S rRNA์— ๋ณด์™„ ์‹œํ€€์Šค์— ๋Œ€ํ•œ DENV ๋ฐ ZIKV 5โ€ฒ-UTR์—์„œ ํ—›๋œ ๊ฒ€์ƒ‰ํ–ˆ์Šต๋‹ˆ๋‹ค. PhotoShine์€ ๋‹น์‹ ์—๊ฒŒ ๋‹ค๋ฅธ ์•„๋ฆ„๋‹ค์šด ํ…œํ”Œ๋ฆฟ์— ์‚ฌ์ง„์„ ์ถ”๊ฐ€ ํ•  ์ˆ˜์žˆ๋Š” ์‰ฌ์šด ๋ฐฉ๋ฒ•์„ ์ œ๊ณตํ•ฉ๋‹ˆ๋‹ค. ํฌํ† ์ƒค์ธ์—์„œ ํ•œ ๋ฒˆ์˜ ํด๋ฆญ์œผ๋กœ ๊ณ ์ „์ ์ธ ์‚ฌ๋ž‘ ์Šคํƒ€์ผ ํ…œํ”Œ๋ฆฟ, ํ•‘ํฌ ์†Œ๋…€ ์Šคํƒ€์ผ ํ…œํ”Œ๋ฆฟ, ์•„๊ธฐ ๋งŒํ™” ํ…œํ”Œ๋ฆฟ ๋˜๋Š” ์žก์ง€ ํ‘œ์ง€ ํ…œํ”Œ๋ฆฟ ๋“ฑ์— ์‚ฌ์ง„์„ ์ถ”๊ฐ€ํ•˜์‹ญ์‹œ์˜ค.

์ฃผ์š” ํŠน์ง• : 1) ํ•œ ๋ฒˆ์˜ ํด๋ฆญ์œผ๋กœ ์‚ฌ์šฉํ•˜๊ธฐ ์‰ฝ๊ณ  ์›ํ•˜๋Š” ํ…œํ”Œ๋ฆฟ์— ์‚ฌ์ง„์„ ์ถ”๊ฐ€ ํ•  ์ˆ˜ ์žˆ์Šต๋‹ˆ๋‹ค. 2) 9 ํ…Œ๋งˆ (์Šคํƒ€์ผ), 680 ๊ฐœ ์ด์ƒ์˜ ์•„๋ฆ„๋‹ค์šด ํ…œํ”Œ๋ฆฟ์ด ํฌํ•จ๋˜์–ด ์žˆ์Šต๋‹ˆ๋‹ค. Fluc ํ™œ์„ฑ(Gluc/Fluc)์— ์˜ํ•ด ์ •๊ทœํ™”๋œ ์ƒ๋Œ€ Gluc ๋ฐœํ˜„ ์ˆ˜์ค€์ž…๋‹ˆ๋‹ค. 4๊ฐœ์˜ ๋…๋ฆฝ์ ์ธ ์‹คํ—˜์œผ๋กœ๋ถ€ํ„ฐ์˜ ํ‰๊ท  ยฑSEM์ด ํ”Œ๋กฏ๋œ๋‹ค. P ๊ฐ’์€ ํ‘œ์‹œ๋œ ์‹œ์ ์—์„œ 2๊ผฌ๋ฆฌ t ๊ฒ€์ •์„ ์‚ฌ์šฉํ•˜์—ฌ ์Œ์ˆ˜ ๋Œ€์กฐ๊ตฐ(Fฮ”H5GP)์— ๋Œ€ํ•œ ๊ฐ’๊ณผ ๊ฐ’์„ ๋น„๊ตํ•˜์—ฌ ๊ฒฐ์ •ํ•˜์˜€๋‹ค. *, P < 0.05; **, P < 0.01. ๋‹ค์šด๋กœ๋“œ ๊ทธ๋ฆผ S7, TIF ํŒŒ์ผ, 0.5 MB. BHK ์„ธํฌ์—์„œ D5GD3 RNA์˜ ์ƒ์ดํ•œ ์–‘์— ์˜ํ•ด ์ง€์‹œ๋˜๋Š” ๋ฒˆ์—ญ ํšจ์œจ. ์ƒ์ดํ•œ ์–‘์˜ RNA๋ฅผ 12์›ฐ ํ”Œ๋ ˆ์ดํŠธ ์ƒ์— ์‹œ๋“œ๋œ BHK ๋‹จ์ธต ์„ธํฌ๋กœ ํ˜•์งˆ๊ฐ์—ผ์‹œ์ผฐ๋‹ค.

Gluc ํ™œ์„ฑ์€ ์ง€์‹œ๋œ ๋ฐ”์™€ ๊ฐ™์ด ํ™˜์ „ ํ›„ ์ƒ์ดํ•œ ์‹œ์ ์—์„œ ์ธก์ •๋˜์—ˆ๋‹ค. 3๊ฐœ์˜ ๋…๋ฆฝ์ ์ธ ์‹คํ—˜์œผ๋กœ๋ถ€ํ„ฐ์˜ ์ˆ˜๋‹จ ยฑSEM์ด ํ”Œ๋กฏ๋œ๋‹ค. ๋‹ค์šด๋กœ๋“œ ๊ทธ๋ฆผ S2, TIF ํŒŒ์ผ, 0.1 MB. DENV2 5โ€ฒ-UTR์€ ๋””์‹œ์ŠคํŠธ๋กœ๋‹‰ mRNA์—์„œ IRES ํ™œ๋™์„ ๋ถ€์—ฌํ•ฉ๋‹ˆ๋‹ค. (a) Fluc ํ™œ์„ฑ์— ์˜ํ•ด ์ •๊ทœํ™”๋œ ์ƒ๋Œ€ ๊ธ€๋ฃจ์‹œ๋ฐœ ๋ฐœํ˜„ ์ˆ˜์ค€์€ ๋„ 3๊ณผ ์—ฐ๊ด€๋œ๋‹ค. (B) 5โ€ฒ ํ”Œ๋Ÿญ์Šค ๊ธฐ์ž RNA์˜ ๋ฒˆ์—ญ ํšจ์œจ. FH5GP ๋ฐ Fฮ”H5GP ๋ฆฌํฌํ„ฐ RNA๋Š” ๊ฐ๊ฐ ์–‘์„ฑ ๋ฐ ์Œ์„ฑ ๋Œ€์กฐ๊ตฐ์œผ๋กœ ํฌํ•จ๋˜์—ˆ๋‹ค. (C) HCV IRES ๋˜๋Š” DENV2 5โ€ฒ-UTR์˜ ๋‚ด๋ถ€ ๊ฐœ์‹œ์— ์˜ํ•ด ์ง€์‹œ ๋œ Gluc ํ‘œํ˜„. ํ”Œ๋Ÿญ์Šค ๋ฐ ๊ธ€๋ฃจํฌ ํ™œ๋™์€ ์ง€์‹œ๋œ ๋ฐ”์™€ ๊ฐ™์ด ํ™˜์ „ ํ›„ ์ƒ์ดํ•œ ์‹œ์ ์—์„œ ์ธก์ •๋˜์—ˆ๋‹ค. 4๊ฐœ์˜ ๋…๋ฆฝ์ ์ธ ์‹คํ—˜์œผ๋กœ๋ถ€ํ„ฐ์˜ ํ‰๊ท  ยฑSEM์ด ํ”Œ๋กฏ๋œ๋‹ค. P ๊ฐ’์€ ํ‘œ์‹œ๋œ ์‹œ์ ์—์„œ 2๊ผฌ๋ฆฌ t ๊ฒ€์ •์„ ์‚ฌ์šฉํ•˜์—ฌ ์Œ์ˆ˜ ๋Œ€์กฐ๊ตฐ(Fฮ”H5GP)์— ๋Œ€ํ•œ ๊ฐ’๊ณผ ๊ฐ’์„ ๋น„๊ตํ•˜์—ฌ ๊ฒฐ์ •ํ•˜์˜€๋‹ค.

**, P < 0.01. ๋‹ค์šด๋กœ๋“œ ๊ทธ๋ฆผ S4, TIF ํŒŒ์ผ, 0.1 MB. qRT-PCR์šฉ ํ”„๋ผ์ด๋จธ. ํ…์ŠคํŠธ S1, DOCX ํŒŒ์ผ, 0.01 MB๋ฅผ ๋‹ค์šด๋กœ๋“œํ•ฉ๋‹ˆ๋‹ค. qRT-PCR์— ์˜ํ•ด ๋ถ„์„๋œ ํ˜•์งˆ๊ฐ์—ผ๋œ ์„ธํฌ์—์„œ๋‹จ์ฒด์ฒดRNA ์ „์‚ฌ์ฒด์˜ ์ƒ๋Œ€์  ์–‘. ์ด RNA๋Š” RNA ์ „์‚ฌ์ฒด๋กœ ํ˜•์งˆ๊ฐ์—ผ๋œ ์„ธํฌ๋กœ๋ถ€ํ„ฐ TRIzol ์‹œ์•ฝ์— ์˜ํ•ด ์ถ”์ถœ๋ฐ ๋ถ„๋ฆฌ๋˜์—ˆ๋‹ค. RNA ์ˆ˜์ค€์€ qRT-PCR์— ์˜ํ•ด ์ธก์ •๋˜์—ˆ๊ณ  GAPDH์— ์˜ํ•ด ์ •๊ทœํ™”๋˜์—ˆ๋‹ค. m7GpppA RNA์˜ ์ƒ๋Œ€์  ์–‘์€ ์ธ์œ„์ ์œผ๋กœ 1๋กœ ์„ค์ •๋˜์—ˆ๋‹ค. 3๊ฐœ์˜ ๋…๋ฆฝ์ ์ธ ์‹คํ—˜์œผ๋กœ๋ถ€ํ„ฐ์˜ ์ˆ˜๋‹จ ยฑSEM์ด ํ”Œ๋กฏ๋œ๋‹ค. P ๊ฐ’์€ ํ‘œ์‹œ๋œ ์‹œ์ ์—์„œ ์ƒ˜ํ”Œ ๊ฐ„์— ์œ ์˜ํ•œ ์ฐจ์ด๋ฅผ ๋‚˜ํƒ€๋‚ด์ง€ ์•Š์•˜๋‹ค. ๋‹ค์šด๋กœ๋“œ ๊ทธ๋ฆผ S3, TIF ํŒŒ์ผ, 0.1 MB. ์ฃผ์š” ํŠน์ง• : 1) ํ•œ ๋ฒˆ์˜ ํด๋ฆญ์œผ๋กœ ์‚ฌ์šฉํ•˜๊ธฐ ์‰ฝ๊ณ  ์›ํ•˜๋Š” ํ…œํ”Œ๋ฆฟ์— ์‚ฌ์ง„์„ ์ถ”๊ฐ€ ํ•  ์ˆ˜ ์žˆ์Šต๋‹ˆ๋‹ค.

2) 9 ํ…Œ๋งˆ (์Šคํƒ€์ผ), 680 ๊ฐœ ์ด์ƒ์˜ ์•„๋ฆ„๋‹ค์šด ํ…œํ”Œ๋ฆฟ์ด ํฌํ•จ๋˜์–ด ์žˆ์Šต๋‹ˆ๋‹ค. 9 ๊ฐ€์ง€ ํ…Œ๋งˆ๋Š” ์†Œ๋…€, ์•„๊ธฐ, ์‚ฌ๋ž‘, ์‹œ๋ฎฌ๋ ˆ์ด์…˜, ๊ฟˆ, ์žก์ง€, ์ถ•์ œ, ํ”„๋ ˆ์ž„ ๋ฐ ๊ธฐํƒ€์ž…๋‹ˆ๋‹ค.